从癌症或遗传病基础分子机理研究到临床检测，NGS技术的快速发展已经深入到生物医学的方方面面。当测序通量和分析速度逐渐解决，随之而来的则是如何从海量的变异位点中筛选出真正具有临床意义或潜在临床意义的基因位点。变异位点注释和筛选过程看似不需要复杂的算法和高性能计算，但实际上该领域却成为了目前精准医学行业的最大瓶颈之一。这个过程要求在短时间内对突变位点的致病性和临床意义进行快速准确的判断，并提供适合各个病人的用药指导和临床干预建议，这不仅需要同时整合多个数据库的信息，阅读大量文献，还需要从业人员对变异分类标准和权威指南有深入的理解，才能做出快速准确的判断。
虽然目前行业内已经拥有了ACMG-AMP位点解读权威指南，但是有研究显示，即使根据相同的指南不同实验室做出的位点解读仍然有不少的差异。比如在2016 年，研究者通过评估美国9个顶级实验室采用ACMG-AMP指南对99个变异位点的分级结果后发现，评级的一致性只有34%；在不一致的结果中，有高达22%的结果对临床判断会造成严重影响（比如，致病性的突变判断为良性突变等）。这样的差异主要源于解读中整合的文献、数据库信息不完整不充分。
9个实验室对99个变异位点的分类一致性结果 Amendola LM, et. al. AJHG 2016
在国内外众多生物技术公司中，QIAGEN早期便敏锐地捕捉到变异位点解读这一挑战。早在2015年，QIAGEN便推出了针对变异位点解读的临床决策支持系统QIAGEN Clinical Insight Interpret（QCI-I）。在过去的几年，这个系统在业内已经得到了广泛的使用，使用结果和评估在ASHG 等多个国际会议上进行了发表和报告。从去年开始，凯杰有幸和复旦肿瘤医院周晓燕老师课题组在临床变异解读领域展开合作，对QCI-I的表现进行了细致全面的评估，快来听听专家的体会和感受吧！
以下采访包含如下主题：
• 目前NGS报告解读的现状和工作流程• 人工报告解读目前面临哪些困难和挑战• QCI-I和人工报告解读一致性比较• QCI-I数据库的完善程度和时效性判断• QCI-I优势？• NGS报告解读今后的发展方向和展望
问：目前NGS报告解读的现状如何？工作流程是怎样的？
答：随着测序技术的迅猛发展和精准医疗需求的日益增加，基于下一代测序（NGS）的基因检测已广泛应用于肿瘤、遗传病、血液病等多个领域。临床基因检测报告对于遗传基因筛查，靶向药物疗效评估和监测，疾病分子分型和预后研究等有重要指导价值。
在临床工作中，对基因变异解读包括胚系基因变异和体系基因变异解读两种，两者的侧重点有所不同，但都需要对变异进行致病性分析和临床意义分析。
胚系基因变异致病性主要根据American College of Medical Genetics and Genomics（ACMG）的指南或相关指南将变异分为致病、疑似致病、意义未明、疑似良性、良性五个等级。而其临床意义分析重点是弄清楚检测到的变异和疾病的关系，判断其致病性和遗传性，针对该疾病和突变可能有的干预治疗措施和家属患病风险等，给出合理建议。
体系基因变异致病性判断暂时没有统一标准，目前通常参照ACMG标准并结合其他临床相关研究信息来进行判断；其临床意义重点包括变异位点和疾病预防、诊断、治疗和预后等多个方面的关联判断，对于癌症患者还要提示变异与临床诊疗的相关性、证据级别或潜在价值。
体细胞突变解读AMP指南指出，体细胞突变根据变异位点和疾病预防、诊断、治疗和预后多个方面的关联判断可以分为四个级别(The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 19, No. 1, January 2017)。
问：您觉得人工报告解读目前面临哪些困难和挑战？
答：基因检测报告解读也面临着巨大挑战。首先，基因检测报告中基因变异的解读缺乏统一的标准，不同人员对规则的理解不同，获取信息的来源和能力不同，导致不同机构的解读差异较大。第二，基因变异解读需要同时参考多种信息，人工解读工作量大、耗时久，且知识储备更新也较慢。 随着基因检测需求量的增多以及基因检测panel中基因数目的增加，这样的困难会日益凸显。
根据ACMG指南，对于每一个变异位点致病性评估都需要参考多种支持性信息，如该变异在正常人群数据库（如gnomAD数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库等）中的各种族中的最高等位基因频率、是否已有对于该变异致病或不致病的文献报道（是否有功能试验支持）、软件预测对蛋白功能及结构的影响、家系中与症状共分离情况、是否属于新生变异等。
对基因变异临床意义的分析也需要诊断、预后及治疗相关的最新进展，比如FDA或NCCN指南批准的癌症用药信息，开展的药物临床实验信息，文献中实验室开展的药物实验信息等等。
尽管已有一些公共数据库对上述的部分信息进行了一定的归纳和整理，但是查询如此多的信息还是非常的耗时耗力。虽然解读人员可以在长期的工作中建立实验室的本地数据库，但是信息更新速度非常快，靠人工来更新信息无疑也是一项非常繁重复杂的工作。
问：凯杰的报告解读辅助系统QCI-I和人工报告解读一致性如何？目前达到的一致性标准是否可以满足实际工作的需要呢？
答：我们做了一个小项目，利用凯杰QCI-I系统对99例临床真实样本进行了分析，并比较了QCI-I判读结果和我们人工判读的一致性和准确性。基于这99例数据，我们可以初步判断QCI-I报告解读系统和人工报告解读的整体一致性在80%左右。
我们对不同的突变类型还进行了更细致的分析，在移码突变和可变剪切突变中QCI-I与人工解读的一致率能高达97%，错义突变一致率77%，框内小片段插入缺失一致率87%。QCI-I提供的支持性信息比较全面，同时使用者可以通过增加和降低支持性证据的权重对评级进行调整，设定定制化的报告规则和策略，能够很大程度的提高实验室的出报告效率，节省人员时间。
此外，QCI-I提供友好的用户操作界面，上传VCF文件后直接通过鼠标的点击以及简单的数据填写即可得到最终的结果，操作比较简单。
问：QCI-I是基于Qiagen Knowledge Base数据库创建的，基于您的使用，您能谈谈您对这个数据库的看法吗？比如信息的完善程度，时效性等？
答：QCI-I提供的信息比较全面，除了给出变异位点致病性的评估和临床意义的评估外，还提供了很多具体的支持证据。这包括变异位点在转录本上的直观定位展示图，在各数据库中各种族人群发生频率，在ClinVar等数据库中的评级，文献证据，变异对蛋白功能及结构的影响预测等。同时，QCI-I针对每个变异会提供FDA、NCCN等全球权威指南的支持信息以及最新的临床实验药物信息，基本涵盖了ACMG指南中要求的所有支持性证据类型。
QCI-I界面举例。
问：通过较长时间的使用QCI-I，您觉得QCI-I具有哪些优势？
答：第一，QCI-I提供的信息比较全面，且可以通过增加和降低支持性证据的权重对评级进行调整，并可以将自己的评级进行保存，保证了结果的准确性；
第二，数据库更新快，在我使的近5个月中已经看到了QCI-I的一次较大的版本更新，而且平时的更新也是比较频繁的，这样就保证了信息的准确性；
第三，操作简单，直接上传vcf文件即可，同时QCI-I可以对上传的VCF文件按照自定义阈值进行初步的筛选，比较便捷，更加适合大panel的变异分析；
问：请问您对QCI-I这类报告解读软件还有那些期待？ 答：目前市面上已经有不少的的报告解读软件，很多有自己的优势，但也都有不足之处。在使用QCI-I的过程中，我们也发现一些有待改进的地方，这些也值得这个领域及其他解读软件借鉴。比如在一个分析模式中，如何能做到同时对体细胞突变和胚系突变进行分析；又比如我们希望QCI-I能进一步完善对CNV和fusion 的分析，能细致到针对fusion 基因的不同断裂点给出详细的证据和解析。随着生物学、医学研究以及临床实验的开展，将有更多的基因变异出现，也将有更多变异的致病性和临床意义得到进一步的明确，我们希望以这些明确致病性和临床意义的变异为基础，提出更细化、更明确的规则来完善临床基因变异解读体系。此外，随着深度学习、数据挖掘等人工智能领域的发展，在保证准确性的基础上，希望能进一步提高报告软件的自动化程度，适应样本量的快速发展。多种形式的自动化解读结合人工审核将是未来发展的一个重要趋势，两者结合将使NGS结果解读速度更快，报告更准确，为医生和患者提供更好的帮助，促进精准医疗的发展。当然这个领域的发展将是一个漫长的过程，需要像Qiagen这样的企业对行业标准和报告解读的相关技术作更多的推动。
了解QIAGEN的QCI-I工具，更准确地解读临床变异
